影响PCR结果的因素有哪些?

  影响PCR结果的因素有哪些?

  1)引物及浓度：①长度：15～30bp。②碱基：G+C含量以40%～60%为宜，ATGC好随机分布，避免5个以上的碱基成串排列。③避免引物内部出现二级结构、两条引物间互补，特别是3′端的互补。④引物3′端的碱基，特别是末及倒数第二个碱基，应严格要求配对。⑤与其它序列无明显同源性。⑥浓度为0.1～1μmol或10～100pmol。

  (2)酶及其浓度：催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100μl时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。

  (3)dNTP的质量与浓度：dNTP应为50～200μmol/L，4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)，过高dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。

  (4)模板：模板的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，避免DNA纯化中的SDS和蛋白酶K等杂质。

  (5)Mg2+浓度：一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200μmol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。

  (6)温度与时间：①变性：93℃～94lmin℃，过高或过低的温度影响酶的活性。②退火：取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。一般高于Tm值5℃～10℃，时间为30～60s。③延伸：常用温度为72℃，时间根据待扩增片段的长度而定。

  (7)循环次数：主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。

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