七色多重免疫荧光经常会遇到的技术问题？

  七色多重免疫荧光经常会遇到的技术问题

  FAQ(问题)：

  1. 问：为什么会串色?

  答：串色与多种因素有关系：A 可能与成像设备滤光片带宽有关系，尽量选用窄波长带宽的滤光片;B 可能与上一轮抗体未被完全洗脱关系，对于一些亲和力比较高的抗体比如CK等，抗体洗脱条件需要延长(提高洗脱温度 时间等);C 可能与信号不平衡有关系，比如相邻两个通道染料，一个强度过高，一个过低，导致强的信号发生外溢;D其他可能存在的原因，比如抗体弄混，下一轮抗体忘记洗脱/修复等。

  2. 问：TYR-xxxPlus荧光染料与TSA buffer稀释比例怎样优化?

  答：本试剂盒灵敏度比较高，是常规TSA试剂盒的10-50倍，注意信号不要过强;信号过强 则降低染料浓度/反应时间/一抗浓度，信号过低 提高染料浓度/反应时间/一抗浓度;本试剂盒的特点，浓度越高，将成指数倍增强信号;1:50能获得强信号，1:500相当于常规TSA信号。

  3. 问：抗原修复方式/抗体洗脱方式怎么选择?

  答：建议轮抗原修复9.0 EDTA,95度15-25min;第二轮或以上抗体洗脱/抗原修复，建议柠檬酸6.0 95度25min-40min，针对一些容易掉片的组织，抗体洗脱可以采用抗体洗脱液(我司有卖：mIHC专用抗体洗脱液)，抗体洗脱液时间过长可能会导致抗原识别降低/dapi核弱染，注意把控抗体洗脱液时间(一般室温或者37度5-15min，1-2次能到到比较理想的结果)。

  4. 问：染料是否需要避光?

  答：本试剂盒荧光染料抗淬灭性强，全程无需日光灯下避光，使用过程中也无需在暗环境中操作，但不能在太阳光下照射。

  5. 问：做多标时，指标/抗体顺序如何选择?

  答：难以洗脱的抗体，摆在后一轮，不然容易串色，比较难做的指标放在前面几轮做(比如foxp3)，轮通常做适合EDTA 9.0修复的指标;根据我司经验，轮通常采用EDTA 9.0/高压6.0 第二轮及其以上通常采用6.0，多抗建议6.0 。

  6. 问：为什么有时候有非特异性或者非特异是怎么产生的以及怎样改善?

  答：非特异的产生有几种可能，A：抗体是多克隆的，容易产生非特异，可以换用单克隆抗体或者降低浓度以及修复强度来改善;B:信号放大过强，可以降低染液反应时间或者浓度;C：一抗浓度过高或者修复过度，采用比较低的稀释抗体比例，或降低修复强度(温度或者时间或者修复液PH)。

  7. 问：做石蜡切片mIHC,抗体应该怎样选择?

  答：尽量选用单克隆抗体，抗体应用选用IHC /mIHC/ IHC-P,优先选用经过敲除验证的抗体等。

  8. 问：本试剂盒对于其他进口/国产试剂盒优势在哪里?

  答：A：超高的性价比，其他品牌试剂盒动辄过万，我司试剂盒价格在2k-1w之间;B 稳定性好：即使试剂盒不小心被放在常温，也能在一个月的放置后，可以继续使用 以及检测信号灵敏度无差异，茹创生物开发的此款试剂盒，采用了新配方，有各种保护剂 防腐剂 H2O2稳定剂等成分，极大提高了试剂盒稳定性;C 超高灵敏度：高灵敏度可以达到市场其他公司的10-50倍。

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