怎样制备多克隆抗体?

  怎样制备多克隆抗体?

  1. 器材：

  剪刀(剪兔毛用)一把、弯头眼科*子(游离血管用)一把、直头眼科*(剪血管用)一把，*架，*片，注射器(1ml、10ml，25ml)附针头，兔子固定架，灭菌三角烧瓶(200ml)或平皿(直径18cm)、弯头*四把，直头*两把，手术缝合线，塑料放血管，纱布等。

  2. 试剂：

  生理盐水(或PBS)，

  弗氏*佐剂(Freund’s complete adjuvant, FCA) Sigma F-5881，

  弗氏不*佐剂(Freund’s incomplete adjuvant, FIA) Sigma F-5506，

  二甲苯，酒精棉，脱脂棉，2% NaN3

  3. 兔子的选择：

  兔子的重量应在四斤以上，两耳光滑，明显可见耳静、动脉，健康。

  4. Pre-bleeding：

  抗原注射以前需要收集一些正常血清，已备检测抗体时作为阴性对照。待兔子在新环境中稳定，大概需要四天左右时间，可以进行耳动脉取血。取血量约5ml足矣。

  免疫用的抗原必须纯化，否则影响抗体的质量。抗原经FCA或FIA充分乳化后才能注射。将抗原液与佐剂等比例混合后，置于混合器上使之剧烈振荡使抗原充分乳化，乳化过程比较费时、费力，但若乳化不充分，会影响免疫的效果，振荡后，1000rpm离心一分钟，如水相和油相不分层即可注射。免疫用FCA，以后都用FIA。

  免疫方法可采用背部多点注射法。即于家兔脊柱两旁选4-6点皮下注射，每点注0.1ml，间隔2周后再于上述部位选不同点注射(不要选择临近位点，否则溃疡愈合不好)。每次免疫的抗原量约100μg。免疫次数在四五次即可，抗原用量大可以减少次数。

  免疫一周后，可以耳动脉取血检测抗体效价。因为起初几次免疫产生的抗体的效价比较低，头两次取血，够检测用即可。在三次免疫后，可以获得较价的抗体，每次取血量可以在40ml，不要取太多，否则会造成兔子贫血。zui后一次取血可以采用颈动脉放血，具体操作如下：

  a.家兔仰卧于兔架上固定头部，用纱布固定四肢。头部略放低以暴露颈部。剃毛并消毒皮肤;

  b.沿颈部中线用*切开皮肤约10cm，分离皮下结缔组织，直至暴露出气管两侧的胸锁乳突肌(小心操作，如碰到小血管出血，可用*止血)

  c.用直头*分离胸锁乳突肌与气管间的颈三角区疏松组织，暴露出颈总动脉后用弯头*使之游离，剥离神经和结缔组织;

  d.于动脉下套入两根黑丝线，分别置于远心及近心端。结扎远心端的丝线。近心端的动脉用*夹住;

  e.用小拇指垫在血管下，用尖头眼科*在两根丝线间的动脉璧上剪一小口(勿剪断)，插入塑料放血管。再将近心端的丝线结扎固定于放血管上，以防放血管滑脱;

  f.松开*，使血液流入容器中。一般一只家兔可放血100-120ml。

  5. 血清的分离：

  如果用三角瓶或平皿盛血，将器皿倾斜放置于37oC烘箱2hr，转移到4oC沉淀过夜，第二天早上用吸管吸取血清。如果用离心管收集，37oC烘箱放置2hr，转移到4oC沉淀过夜，第二天早上离心，10000RCF，10分钟。在血清中加入 NaN3 至终浓度0.02%，分装后-20oC保存。

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