辛基-琼脂糖凝胶 4FF使用方法？

  辛基-琼脂糖凝胶 4FF使用方法

  1.装柱：

  a、让所有的材料和试剂达到室温;配制初始缓冲液(平衡液)和洗脱缓冲液。

  b、根据柱子大小取所需量的凝胶，清洗掉20%乙醇，抽干，用初始缓冲液(按凝胶：缓冲液=3：1的比例)配成匀浆。

  c、将柱内及柱子底端用水或缓冲液润湿并保持一小段液位(液面略高于滤膜)，务必使底端无气泡。

  d、用玻璃棒引导匀浆沿着柱内壁一次性倒入柱内，注意勿使产生气泡;打开柱子出液口，使凝胶在柱内自由沉降，连结好柱子顶端柱头。

  e、打开蠕动泵，让缓冲液用使用时流速的1.33倍的流速流过，使柱床稳定;用2~3柱体积的缓冲液平衡柱子。

  2.平衡：

  让平衡缓冲液以一定流速流过柱子，到流出液电导和pH不变;平衡缓冲液一般是高盐浓度的缓冲液，如0.02~0.05mol/L的PBS加1~2.5mol/L(NH4)2SO4等。

  3.上样：

  a、样品用平衡液配制，浑浊的样品要离心和过滤后上样。

  b、一般情况是让目标产品结合在柱子上，用平衡液洗去杂质，再选择一种洗脱液洗下目标产品。

  c、介质对样品组分吸附的程度取决于样品的疏水性质、流动相的离子强度和温度;盐浓度大、温度高或样品组分疏水性强，介质对组分吸附牢。

  4.洗脱：

  疏水介质可用减小盐浓度进行洗脱;加表面活性剂或有机溶剂可加强洗脱;zui常用的洗脱液是低盐浓度缓冲液，如0.02~0.05mol/L的PBS。

  5.再生：

  一般用低盐浓度的缓冲液洗，洗10倍以上柱体积，接着用结合蛋白的平衡液洗到平衡，可再次使用;若有失活蛋白质或脂类物质在再生时洗不掉，可用在位清洗(CIP)除去。

  6.在位清洗：

  a、对于以离子键结合上去的蛋白，可以用2MNacl去除。

  b、对沉淀蛋白、对以疏水性结合的蛋白或脂类，可用1MNaOH去除。

  c、对强疏水性结合的蛋白、脂类等，用4~10倍柱体积的70%乙醇或30%异丙醇清洗，但要注意有机溶剂的浓度以梯度的方式逐渐增加，否则容易产生气泡;清洗完毕后，用至少3倍缓冲液平衡柱子。

  7.去热源：

  用0.5M的氢氧化钠清洗柱子5~6小时或用0.1M的氢氧化钠24小时;或用以下方法步骤去除：

  a、2倍柱体积的70%乙醇;

  b、2倍柱体积50mMTris-HclpH7.5;

  c、1倍柱体积4M尿素;

  d、3倍柱体积的Tris缓冲液+0.1MNaCl;上缓冲液都在无热源的双蒸水中配制。

  8.消毒：

  用0.5~1MNaOH室温下洗8~10倍柱体积，初始缓冲液平衡柱子。

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