琼脂培养基的制备过程?

  琼脂培养基的制备过程?

  1、培养基配方选择

  同一种培养基的配方在不同著作中常会有某些差别。因此，除所用的是标准方法，应严格按其规定进行配制外，一般均应尽量收集有关资料，加以比较核对，再依据自己的使用目的，加以选用，记录其来源。

  2、培养基制备记录

  每次制备培养基均应有记录，包括培养基名称，配方及其来源，和各种成份的牌号，终pH值、消毒的温度和时间制备的日期和制备者等，记录应复制一份，原记录保存备查，复制记录随制好的培养基一同存放、以防发生混乱。

  3、培养基成份称量

  培养基的各种成分必须称取并要注意防止错乱，-好一次完成，不要中断。可将配方置于傍侧，每称完一种成分即在配方上做出记号，并将所需称取的药品一次取齐，置于左侧，每种称取完毕后，即移放于右侧。*称取完毕后，还应进行一次检查。

  4、培养基成份的混合与溶化

  培养基所用化学药品均应是化学纯的。使用的蒸煮锅不得为铜锅或铁锅，以防有微量铜或铁混入培养基中，使细菌不易生长。-好使用不锈钢加热溶化，可放入大烧杯或大烧瓶中置于高压蒸汽灭菌器或流动蒸汽消毒器中蒸煮溶化。

  5、培养基pH值的调正

  pH因培养基在加热消毒过程中、pH会有所变化，培养基各成分*溶解后，应进行pH的初步调正。例如，牛肉浸液约可降低pH0.2，而肠浸液pH却会有显著的升高。因此，对这个步骤，操作者应随时注意探索经验、以期能掌握培养基的终pH，保证培养基的质量。pH调整后，还应将培养基煮沸数分钟，以利培养基沉淀物的析出。

  6、培养基过滤澄清

  液体培养基必须澄清，琼脂培养基也应透明无显著沉淀，因此，须要采用过滤或其它澄清方法以达到此项要求。一般液体培养基可用滤纸过滤法，滤纸应折叠成折扇或漏斗形，以避免因液压不均匀而引起滤纸破裂。

  琼脂培养基可用清洁的白色薄绒布趁热过滤。亦可用中间夹有薄层吸水棉的双层纱布过滤。新制肉、肝、血和土豆等浸液时、则须先用绒布将碎渣滤去，再用滤纸反复过滤。如过滤法不能达到澄清要求、则须用蛋清澄清法。即将冷却至55～60℃的培养基放入大的三角烧瓶内，装入量不得超过烧瓶容量的1/2，每1000ml培养基加入1～2个鸡蛋的蛋白，强力振摇3～5分钟，置于高压蒸汽灭菌器中、121℃加热20分钟、取出趁热以绒布过滤即可。

  7、培养基分装

  培养基的分装，应按使用的目的和要求，分装于试管、烧瓶等适当容器内。分装量不得超过容器装盛量的2/3。容器口可用垫有防湿纸的棉塞封堵，其外还须用防水纸包扎(现试管一般多有用螺旋盖者)。分装时-好能使用半自动或电动的定量分装器。分装琼脂斜面培养基时，分装量应以能形成2/3底层和1/3斜面的量为恰当。

  分装容器应预先清洗干净并经干烤消毒，以利于培养基的*灭菌。每批培养基应另外分装20ml培养基于一小玻璃瓶中，随该批培养基同时灭菌，以为测定该批培养基终pH之用。

  8、培养基灭菌

  一般培养基可采用121℃高压蒸汽灭菌15分钟的方法。在各种培养基制备方法中，如无特殊规定，即可用此法灭菌。

  某些畏热成分，如糖类，应另行配成20%或高的浓液，以过滤或间歇灭菌法消毒，以后再用无菌操作技术、定量加于培养基。明胶培养基亦应用较低温度灭菌。血液、体液和抗生素等则应以无菌操作技术抽取和加入于经冷却约50℃左右的培养基中。

  琼脂斜面培养基应在灭菌后立即取出，冷至55-60℃时，摆成适当斜面，待其自然凝固。

  9、培养基质量测试

  每批培养基制备好以后，应仔细检查一遍，如发现破裂、水分浸入、色泽异常、棉塞被培养基沾染等、均应挑出弃去。并测定其终pH。将全部培养基放入36±1℃恒温箱培养过夜，如发现有菌生长，即弃去。用有关的标准菌株接种1～2管或瓶培养基，培养24～48小时，如无菌生长或生长不好。应追查原因并重复接种一次，如结果仍同前，则该批培养基即应弃去，不能使用。

  9.1 澄清度

  水是细胞培养基的溶剂。细胞培养基中的营养成分只有*溶解于水才能被细胞吸收摄取，细胞才能生长增殖，因此细胞培养基是否溶解以及培养液是否透明澄清直接影响培养基使用。该项目是通过对水溶解后的细胞培养基的澄清度检查，判断细胞培养基的澄清度。按中华人民共和国药典2005年版二部附录ⅨB进行。

  9.2 pH值

  哺乳类动物细胞生长需要合适的酸碱度，pH过高或者过低都会导致细胞死亡。pH值的测定也可以检查细胞培养基的批间差。清大天一标准规定取规定量供试品，用注射用水(水温20℃-30℃)溶解至1L，加入规定量碳酸氢钠到上述溶液中，用与细胞培养基溶液pH值相近的两点标准缓冲液校准后的酸度计进行测定。按中华人民共和国药典2005年版二部附录ⅥH进行;加入规定量的碳酸氢钠到上述溶液中，按中华人民共和国药典2005年版二部附录ⅥH进行。

  9.3 干燥减量的质量分数

  细胞培养基具有吸湿性，在空气中放置水分会很快升高，干燥减量的质量分数表示产品中含湿量。细胞培养基是有菌制剂，其丰富的营养成分有利于微生物生长，控制细胞培养基中的水分可以防止微生物的繁殖，保持细胞培养基的养分。

  9.4 渗透压

  溶剂通过半透膜由低浓度向高浓度溶液扩散的现象称为渗透，阻止渗透所需施加的压力，称为渗透压。细胞必须生活在等渗环境中，动物细胞借助K+、Na+维持渗透平衡。大多数细胞对渗透压有一定的耐受性。但是培养液渗透压过高容易使细胞脱水萎-缩，培养液渗透压过低容易使细胞膨胀破裂，因此要控制培养基的渗透压范围。按中华人民共和国药典2005年版二部附录ⅨG渗透压摩尔浓度测定法进行。

  9.5 细菌内毒素

  细菌内毒素是许多病原性细菌所产生的毒素。它的特殊性在于不是细菌或细菌的代谢产物，而是细菌死亡或解体后才释放出来的一种具有生物活性的物质。培养基细菌内毒素过高，对生物制品疫苗(如狂犬、乙肝疫苗)、基因工程药品等注射用的药品都需要检查细菌内毒素。因此本项目的检验符合生物制品质量控制要求。

  9.6 微生物限度

  细胞培养基不是无菌产品，其中的微生物在一定条件下会吸收细胞培养基中的营养物质滋生繁殖，导致细胞培养基变质失效。控制细胞培养基中细菌和霉菌，是延长细胞培养基有效期的方法之一。

  9.7 细胞生长试验

  这是一个性能特性表述的要求。细胞培养基的功能就是培养哺乳类动物细胞，因此经过细胞培养效果的检验是产品质量优劣的直观表述，这也是很多生物制药用户要求的一项指标。

  10、培养基保存

  培养基应存放于冷暗处，-好能放于普通冰箱内。放置时间不宜超过一周，倾注的平板培养基不宜超过3天。每批培养基均必须附有该批培养基制备记录副页或明显标签。

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