维生素B2 (核黄素) 荧光测定法实验？

  维生素B2 (核黄素) 荧光测定法实验

  实验方法原理 核黄素能形成一种具有黄绿色荧光的黄色溶液。它在稀溶液中，440～500 nm波长下测定的荧光强度与核黄素的浓度成正比。根据其在还原后的荧光差数，可测定核黄素的含量。

  实验材料

  核黄素

  试剂、试剂盒

  高锰-酸钾溶液 荧光红钠 硫代硫酸钠 冰醋-酸

  仪器、耗材

  荧光分光光度计 玻璃器

  溶液配制：

  1. 3 %高锰-酸钾溶液：将高锰-酸钾3 g溶于水，稀释至100 ml，每星期配制一次。

  2. 核黄素标准溶液(0.5 μg/ml)：取储备液(25 μg/ml)1 ml，稀释至50 ml，临用前配制。

  3. 荧光红钠储备溶液(50 μg /ml)：50 mg荧光红钠溶于1000 ml水中。

  4. 荧光红钠应用液(0.05 μg/ml)储备液稀释至1000 ml。

  操作步骤：

  1. 样品提取

  (1)称取含有核黄素5～10 μg的均匀样品于125 ml锥形瓶中，加入50 ml 0.1 mol/L盐酸，置于高压下蒸煮30 min。

  (2)将样品冷却，用氢氧-化钠调至pH 6.0(因核黄素在碱性溶液中不稳定，滴加碱液时边加边摇，避免局部碱性过强)，再迅速用1 mol/L盐酸调至pH 4.5，使杂质沉淀。

  (3)用水稀释至100 ml，过滤。如样品量过大，可过滤后稀释，样品稀释度由所用标准液浓度来定。

  2. 滤液酸化

  (1)取两个试管(A)，分别加入10 ml滤液和1 ml水。

  (2)另取两个试管(B)，分别加入10 ml滤液和1 ml核黄素标准液(0.5 μg/ml)。

  (3)以上四个管各加1 ml冰醋-酸。

  3. 纯化

  (1)每个试管各加入0.5 ml 3%高锰-酸钾，混匀后放置2 min以充分氧-化样品内的杂质。

  (2)另取两个试管(C)，分别加入10 ml滤液和1 ml水及1 ml冰醋-酸，然后向两支试管中各加入20 mg硫代硫酸钠，使样品中的杂质与核黄素都还原成无荧光物质，再摇动，使核黄素与空气接触而被氧-化，测其荧光。

  (3)在A、B管内各加0.5 ml 3%双氧-水(其不宜过量，以免产生气泡，影响荧光读数)，混匀，10 s内褪去颜色。

  4. 荧光测定

  (1)用荧光红钠溶液调整指针，使之每次都在一定的读数上(如50～80)。

  (2)滤液加水的荧光读数为A。

  (3)滤液加标准液的荧光读数为B。

  (4)滤液内加硫代硫酸钠的荧光读数为C。

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