古朵生物 细胞裂解液各成分的作用与制备？

  细胞裂解液各成分的作用与制备

  细胞裂解液各成分的作用：

  1、种50mmol/L Tris-HCl是缓冲液，保证细胞裂解时PH值也能稳定，Tris是一种有机碱。

  2、第二种1.0 mmol/L EDTA是一种金属螯合剂。

  3、第三种150 mmol/L NaCl是等渗体系电解质，用于协调细胞膜内外离子平衡。

  4、第四种0.1% SDS是十二烷基硫酸钠，是一种表面活性剂和还原剂，有增溶作用。

  细胞裂解液的制备：

  一、试剂准备

  1、新鲜配制冷的 RIPA 裂解缓冲液:

  150 mM NaCL

  1% NP-40 (去垢剂)

  0.1% SDS (去垢剂)

  2ug/ml Aprotinin (蛋白酶抑制剂) (使用前加入)

  2ug/ml Leupeptin (蛋白酶抑制剂) (使用前加入)

  1 mM PMSF (蛋白酶抑制剂)

  1.5 mM EDTA (蛋白酶抑制剂)

  1mM NaVanadate (磷酸脂酶抑制剂)(任选)

  以上所有试剂均按比例溶于150 mM NaCL溶液中。

  2、冷的PBS 中加入 1 mM PMSF

  1.5 mM EDTA

  1mM NaVanadate (钒酸钠)(任选)

  3、对数期生长状态佳的细胞，75cm至少3-4瓶(90%以上生长面积)。

  二、实验步骤

  1、将长满细胞的培养瓶放置在冰上， 用吸液管吸出培养液。加入足够的冷的 PBS在培养瓶中充分洗涤细胞表面，以洗去瓶中残留的培养基，倒掉PBS ，重复以上操作2-3遍。在后一次洗涤中尽可能吸干残留的PBS，尽量在冰上操作。

  2、向培养瓶中加入冷的RIPA 裂解缓冲液 (每75cm2 培养瓶加1ml). 然后用细胞刮子沿着瓶壁开始刮细胞，如果所需要刮的同种细胞有多瓶，则将瓶刮下的细胞液吸出转入下一瓶中继续刮 (由于处理后的细胞裂解液较粘稠，所以宜用直径大点的吸液管吸取)。

  3、吸出刮好的细胞裂解液置于14ml 离心管中 (置于冰上)，然后重复步骤2以刮取剩下的细胞。

  4、尽可能将多的细胞裂解液收集到14ml的离心管中，样品插入冰盒进行超声，超声强度以不产生泡沫为准，超声每次2-3秒，重复3-4次。如仍有细胞碎片或沉淀，应离心10000rpm,10分钟，留取上清。

  5、取出小量细胞裂解液测其蛋白浓度(用Biorad Bradford 试剂盒或紫外分光光度计，在A280测定)，分装保存在 -70℃。

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